proces polegający na usunięciu reszty fosforanowej (grupy fosforanowej) z cząsteczki związku chemicznego, najczęściej z białka lub nukleotydu. W komórkach defosforylacja jest reakcją enzymatyczną, którą przeprowadzają fosfatazy – enzymy odłączające grupę fosforanową. Defosforylacja pełni kluczową rolę w regulacji aktywności wielu białek, zwłaszcza enzymów, wpływając na przebieg różnych szlaków metabolicznych i procesów komórkowych. Defosforylacja jest przeciwieństwem fosforylacji i razem z nią tworzy mechanizm włączania i wyłączania funkcji białek, m.in. w odpowiedzi na sygnały docierające do komórki.