Zestaw fragmentów DNA, reprezentujących cały genom (kompletny zestaw genów i sekwencji niekodujących) określonego organizmu, które zostały sklonowane w wektorach, takich jak plazmidy lub bakteriofagi. Pierwszym krokiem w tworzeniu biblioteki genomowej jest izolacja DNA z komórek lub tkanek organizmu, a następnie pocięcie na mniejsze fragmenty za pomocą enzymów restrykcyjnych. Fragmenty DNA są łączone z odpowiednimi wektorami i wprowadzane do komórek bakteryjnych, które namnażają się, co prowadzi do powstania klonów i utworzenia biblioteki genomowej. Każdy klon reprezentuje pewien fragment genomu. Klonowane fragmenty genomu mogą być wyizolowane i poddane analizie, co pozwala na zidentyfikowanie sekwencji DNA oraz genów, które znajdują się w danej bibliotece genomowej.