Rodzaj biblioteki, która posiada powielone fragmenty komplementarnego DNA (cDNA). Są tworzone na podstawie informacji znajdującej się w mRNA przy pomocy enzymu odwrotnej transkryptazy (syntetyzuje jednoniciowe DNA, drugą nić syntetyzuję polimeraza DNA). Otrzymane cząsteczki cDNA są klonowane do odpowiedniego wektora (często plazmidowego lub wirusowego), co pozwala na pomnożenie tych cząsteczek i utworzenie biblioteki cDNA. Każdy klon reprezentuje jeden gen. Biblioteka cDNA może być wykorzystywana do analizy ekspresji genów w określonych warunkach, identyfikacji genów, badania funkcji genów oraz innych badań związanych z genetyką i biologią molekularną.